當我們歷經(jīng)種種挑戰(zhàn)獲得實驗結(jié)果，經(jīng)常會發(fā)出疑問三連：

• 我的實驗結(jié)果是不是準確？
• 我的結(jié)果是否出現(xiàn)假陽性或假陰性？
• 結(jié)果的差異是不是因?qū)嶒炘O(shè)計中的變量造成的？

要回答這些問題，合適的對照樣品就成了不可或缺的一環(huán)。

一、陰性對照與陽性對照

• Western Blot 實驗結(jié)果有雜帶？
• IHC 實驗沒有陽性信號？
• 目的蛋白表達定位與文獻報道的有出入怎么辦？

要回答這些問題，就需要在實驗中設(shè)置陰性或陽性對照。

陽性對照品一般會使用文獻或數(shù)據(jù)庫中報道的高表達目的蛋白的組織或細胞。陽性對照確保了實驗的靈敏度，也保證了實驗過程中抗原抗體的結(jié)合效率。

陰性對照品一般會使用或文獻或數(shù)據(jù)庫中報道的低表達目的蛋白的組織或細胞，使用敲低或敲除目的基因的樣本。在 IHC/ICC 實驗中，也可以用 PBS 或同型對照代替一抗。陰性對照確保了實驗的特異性，排除非特異性信號對結(jié)果造成的干擾。

接下來，我們舉個例子：

比如用二乙基亞硝胺誘導小鼠肝纖維化，常常用 Alpha-SMA 作為肝纖維化的標志物。在進行 IHC 實驗時，為了保證陽性信號的可靠性，就需要平行加一個胃或結(jié)腸組織的樣本作為對照。因為，Alpha-SMA 會特異性的表達在平滑肌細胞，而黏膜細胞無表達。

圖片來源：W Li et al. Cell Death Dis (2019).

如上圖的所示，胃平滑肌層陽性信號明顯，黏膜層無陽性信號，證明抗體得到的信號是敏感且特異的（Alpha-SMA，貨號 NBP2-33006）。

二、同型對照

這個概念，相信深諳流式細胞技術(shù)的小伙伴都耳熟能詳。因為抗體本身的特殊功能，特別是抗體 IgG Fc 段與細胞的 Fc 受體結(jié)合的能力，會使實驗結(jié)果的非特異性信號加強。

同時，在一些抗體的功能性實驗，比如中和實驗和封閉實驗中，也會對細胞（尤其是免疫細胞）的生理功能產(chǎn)生一定的影響，進而導致實驗結(jié)果與預期或文獻報道不相符。

抗體結(jié)構(gòu)與抗體類型示意圖

這時，同型對照就是必不可少的工具：

同型對照是陰性對照的一種，是利用與實驗抗體同亞型的免疫球蛋白，排除實驗本底信號的工具。廣泛運用在免疫組化、免疫熒光、流式細胞術(shù)、抗體封閉中和實驗等一些以抗原-抗體結(jié)合為基礎(chǔ)的實驗中。

同型對照需要選用與目標抗體相同種屬來源、相同的免疫球蛋白類型及亞型的抗體。如果是應(yīng)用在流式細胞術(shù)，還需要標記相同的熒光素。我們通常建議選用來自與特異熒光抗體相同生產(chǎn)廠家的同型對照抗體, 因為其生產(chǎn)工藝、熒光蛋白比值以及標記工藝都是相同的。

比如：

用  Mouse Anti-Human MICA PE-conjugated Monoclonal Antibody（貨號 FAB1300P）檢測 K562  細胞表面的 MICA，因為該抗體的種屬來源是小鼠，免疫球蛋白是 IgG，亞型是 2B，標記的熒光素是 PE，所以，我們使用的同型對照應(yīng)該是 Mouse IgG2B PE 抗體（貨號 IC0041P）。

如上圖，左邊藍色的峰為同型對照，右邊橙色的峰為 MICA 特異性的 PE 信號峰。有了同型對照，自然就能分辨出合適的陽性熒光強度，為之后設(shè)門和進一步分析打下可靠的基礎(chǔ)。

設(shè)置合適的對照就像給實驗加上一層保險，保證了實驗結(jié)果的可靠性，也為后續(xù)實驗的優(yōu)化及 trouble shooting 提供了重要的線索。

以上文字和圖片來源于Bio-techne